На правах рукописи

ЕЛИСЕЕВА  МАРИЯ АНДРЕЕВНА

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ  МАКРОФАГОВ И ВЛИЯНИЕ НА НЕГО IN VITRO ПРЕПАРАТА ГЛЮКОЗАМИНИЛМУРАМИЛДИПЕПТИДА (ГМДП) У ЖЕНЩИН С НАРУЖНЫМ ГЕНИТАЛЬНЫМ ЭНДОМЕТРИОЗОМ

14.01.01 – акушерство и гинекология
14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук

Иваново 2010
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. 
Научные руководители: 
Заслуженный деятель науки РФ, 
заслуженный врач РФ,
доктор медицинских наук, профессор     Посисеева Любовь Валентиновна                
    доктор биологических наук                      Анциферова Юлия Станиславовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор     
(ГУЗ «Московский областной 
научно-исследовательский институт 
акушерства и гинекологии» 
Минздрава Московской области)             Попов Александр Анатольевич

доктор медицинских наук, профессор     
(ГОУ ВПО «Российский государственный
 медицинский университет Росздрава»)   Козлов Иван Генрихович
Ведущая организация – ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «__» декабря 2010 года в «_____» часов на заседании диссертационного совета Д208.028.01 при ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Минздравсоцразвития России по адресу: 153045, Россия, г. Иваново, ул. Победы, 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Ив НИИ М и Д              им. В.Н. Городкова» Минздравсоцразвития России. 

Автореферат разослан «____ » ноября 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета 
доктор медицинских наук			                                 И.А.Панова 
Актуальность научного исследования
Эндометриоз относится к числу наиболее распространенных гинекологических заболеваний, сопровождается нарушением менструальной и репродуктивной функций, стойким болевым синдромом, снижением трудоспособности больных (Адамян Л.В., 2010; Кудрина Е.А., 2010; Khan K.N., е.а., 2008). Частота его встречаемости среди женщин репродуктивного возраста составляет по данным разных авторов 5-15% (Rodgers P.A., е.а., 2009), при этом у женщин с бесплодием неясной этиологии  эндометриоз диагностируется в 40-60% случаев (Высоцкий М.М. с соавт., 2009; Ozkan S., e.a., 2008; Rogers P.A, e.a., 2009). Согласно статистическим данным, в последние годы отмечен значительный рост заболеваемости эндометриозом (Адамян Л.В., Осипова А.А., 2010; Э.К. Айламазян, 2002). Таким образом, проблема изучения патогенеза эндометриоза и поиск новых путей его лечения имеет в настоящее время не только медицинское, но и социальное значение.
Показано, что в механизмах развития эндометриоза важную роль играют иммунные нарушения (Сельков С.А, 2002; Полумисков Д.М., 2007; Шаалали Ю.С., 2010; Barcz E., 2000; Siristatidis C., 2006). В последние годы пристальное внимание уделяется изучению особенностей функционирования перитонеальных макрофагов при эндометриозе (Santanam N., 2002; Sidell N., е.а., 2002 , Khan K.N., е.а., 2008). Установлено, что перитонеальные макрофаги женщин с эндометриозом гиперактивированы, продуцируют большое количество цитокинов и факторов роста (Sidell N ., е.а., 2002 , Khan KN, е.а., 2008). Однако при эндометриозе до сих пор не изучена функция макрофагов как «клеток-мусорщиков». Известно, что одной из важных функций перитонеальных макрофагов является удаление клеточного дебриса и апоптирующих клеток через специфические поверхностные рецепторы, получившие название «рецепторы-мусорщики»  или SRs (Sidell N., 2002; Moore K.J., 2006). Но в литературе отсутствуют данные о характере экспрессии SRs при взаимодействии макрофагов с аутологичным эндометрием при эндометриозе. Так же недостаточно изучены особенности экспрессии других функциональных молекул, например интегриновых молекул и ко-стимуляторных рецепторов, на поверхности перитонеальных макрофагов женщин с наружным генитальным эндометриозом. 
Помимо нарушения функции макрофагов, большое значение в патогенезе эндометриоза имеют изменения на уровне эутопического эндометрия (Vinatier D., е.а, 2000). Исследованиями последних лет было показано, что в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом нарушена экспрессия минорных трансплантационных антигенов, ряда интегриновых и адгезионных молекул (Vinatier D., е.а, 2000). Противоречивые данные получены при изучении особенностей экспрессии в эндометрии белков теплового шока или HSP молекул, обладающих цитопротективным действием. Сообщалось о повышении экспрессии ряда HSP в эутопическом эндометрии (Ota H.. е.а., 1997) и в ткани очага эндометриоза (Matsuzaki S., е.а., 2006). Также есть данные об отсутствии выраженных изменений в экспрессии HSP в эндометрии пациенток с эндометриозом (Nip MM., е.а., 1994). Пока еще не установлены факторы, которые могут влиять на изменение экспрессии HSP молекул в эндометрии женщин с эндометриозом. 
В настоящее время возрос интерес исследователей к проблеме медикаментозной коррекции иммунных нарушений у женщин с наружным генитальным эндометриозом (Сельков С.А., 2002; Шаалали Ю.С., 2010). Однако до настоящего времени не проводилось изучение возможного направленного воздействия на функцию перитонеальных макрофагов. Одним из препаратов, оказывающих влияние на фагоциты, является Ликопид. В состав этого препарата входит глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП), который является компонентом пептидогликанов, входящих в состав клеточной стенки всех бактерий (Козлов И.Г. 2005). Для лечения женщин с эндометриозом и бесплодием ранее Ликопид не применялся. 
Цель исследования:
Установить новые механизмы развития наружного генитального эндометриоза на основании оценки функционального состояния перитонеальных макрофагов при их взаимодействии с клетками эндометрия и обосновать в опытах in vitro  целесообразность использования препарата глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП) в терапии данной патологии. 
Задачи исследования:
1.	Дать сравнительную характеристику состояния соматического и репродуктивного здоровья женщин с бесплодием, обусловленным наружным генитальным эндометриозом и трубно-перитонеальным фактором. 
2.	Определить особенности экспрессии функциональных молекул (CD11b, CD49e, CD95, CD86) и «рецепторов-мусорщиков» (CD36 и CD204) перитонеальными макрофагами у женщин с ненарушенной репродуктивной функцией и у женщин с бесплодием, обусловленным наружным генитальным эндометриозом и трубно-перитонеальным фактором. 
3.	Выявить особенности экспрессии мРНК белков теплового шока (HSP27) в эутопическом и эктопическом эндометрии у женщин с наружным генитальным эндометриозом.
4.	В эксперименте in vitro определить характер изменений экспрессии функциональных молекул и «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами после их взаимодействия с тканью аутологичного эндометрия, а также  оценить влияние макрофагов и перитонеальной жидкости на экспрессию белков теплового шока (HSP27) клетками эутопического эндометрия при наружном генитальном эндометриозе.
5.	В опытах in vitro установить влияние препарата  ГМДП на функциональное состояние перитонеальных макрофагов у женщин с наружным генитальным эндометриозом и оценить  возможность применения наноразмерных транспортных систем на основе модифицированного кремнезема для направленного транспорта ГМДП в макрофаги. 
Научная новизна исследования
Установлены новые механизмы развития наружного генитального эндометриоза и связанного с ним бесплодия. Выявлено, что развитие с наружного генитального эндометриоза у женщин связано с угнетением экспрессии на поверхности макрофагов «рецепторов-мусорщиков» (CD36 и CD204) и интегриновых молекул (CD49e), а нарушение фертильности у этих больных – со сниженной экспрессией  адгезионных (CD11b) и сигнальных ко-стимуляторных (CD86) молекул перитонеальными макрофагами.
Показано, что в ткани очага эндометриоза повышен синтез цитопротективных молекул HSP27, а перитонеальная жидкость женщин с эндометриозом оказывает стимулирующее действие на экспрессию мРНК HSP27 в эутопическом эндометрии.  
Установлено, что при наружном генитальном эндометриозе нарушено взаимодействие перитонеальных макрофагов с аутологичным эндометрием, что проявляется отсутствием реакции со стороны «рецепторов-мусорщиков» и снижением экспрессии интегриновых и адгезионных молекул CD49e и CD11b на поверхности макрофагов после их стимуляции клетками эндометрия. 
Дано теоретическое обоснование к использованию препарата ГМДП при наружном генитальном эндометриозе. Выявлено стимулирующее действие препарата ГМДП на экспрессию «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием.
Показано, что наноразмерные частицы кремнезема (100 нм в диаметре) специфически связываются с перитонеальными макрофагами, не оказывая влияния на их жизнеспособность и уровень активации. 
Определена возможность топической доставки препарата ГМДП в перитонеальные макрофаги женщин с наружным генитальным эндометриозом с помощью наноразмерной транспортной системы на основе модифицированного кремнезема, при этом эффект действия транспортной наносистемы с ГМДП превышает действие чистого препарата ГМДП.
Практическая значимость исследования
Разработаны нормативные показатели уровня экспрессии «рецепторов-мусорщиков» CD36 и CD204 перитонеальными макрофагами. 
Акушерско-гинекологической практике предложены новые критерии для оценки функционального состояния перитонеальных макрофагов у женщин с  наружным генитальным эндометриозом и бесплодием, связанные с определением экспрессии «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами. 
Обоснована in vitro возможность применения глюкозаминилмурамилдипептида (в составе препарата Ликопид) для коррекции нарушенной функции перитонеальных макрофагов при наружном генитальном эндометриозе.
Дано обоснование к дальнейшему исследованию применения препарата Ликопид в комплексе лечебных мероприятий у женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием. 
Положения, выносимые на защиту
Развитие наружного генитального эндометриоза у женщин связано с угнетением функции «клеток-мусорщиков» перитонеальных макрофагов, приводящим к нарушению взаимодействия макрофагов с эутопическим эндометрием, и с особенностями цитокинового профиля перитонеальной жидкости, которая стимулирует синтез цитопротективной молекулы HSP27 в клетках эндометрия, обуславливая высокую экспрессию HSP27 в ткани эндометриоидного очага. 
Препарат ГМДП in vitro стимулирует экспрессию «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием.
Топическая доставка ГМДП в перитонеальные макрофаги с использованием транспортной наносистемы на основе модифицированного кремнезема в большей степени, чем чистый препарат ГМДП, стимулирует экспрессию «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием и восстанавливает ответ макрофагов на стимуляцию клетками аутологичного эндометрия.  
Апробация работы
Основные результаты  исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались  на: XIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Птербурге»  (С.-Петербург, 2009), 1 Международной научной школе "Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах" (Москва, 2009), 12th International Symposium for Immunology of Reproduction (Varna, Bulgaria, 2009), 13-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука 21 века» (Пущино, 2009), областном фестивале «Молодые ученые – развитию Ивановской области» (Иваново, 2009), XIII Международном конгрессе с курсом эндоскопии «Новые технологи в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 2010), VIII конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010). 
Внедрение результатов работы в практику
Результаты диссертационной работы внедрены в практику гинекологической клиники Федерального государственного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н.Городкова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации».
Личное участие автора
Автором самостоятельно проводился набор материала по теме диссертации, выполнена систематизация и компьютерная обработка полученных результатов.
Самостоятельно проводились отбор пациенток в группы, согласно критериям включения и исключения, обследование и лечение пациенток. Принимала участие в проведении иммунологических исследований и постановке эксперимента. Была проведена систематизация, статистическая обработка, анализ и описание полученных результатов.  
Публикации
По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 – в журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и практические рекомендации. Библиографический указатель включает 205 источников, в том числе 43 отечественных и 162 иностранных источников. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 11 рисунками.
	СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
	Материалы и методы исследования 
Работа выполнена на базе ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н.Городкова» Минздравсоразвития России, директор д.м.н. А.И.Малышкина. Исследования проводились в гинекологической клинике, эндоскопическом отделении - зав. к.м.н. В.Н. Романов, лаборатории клинической иммунологии - зав. д.м.н. профессор Н.Ю. Сотникова, лаборатории патоморфологии и электронной микроскопии - зав. д.м.н. профессор Л.П. Перетятко.
Всего было обследовано 167 женщин: 35 практически здоровых фертильных женщин, поступившие на плановую хирургическую стерилизацию (контрольная группа);  100 женщин с наружным генитальным эндометриозом, ассоциированным с  бесплодием (основная группа); 32 женщины с бесплодием, обусловленным трубно-перитонеальным фактором (группа сравнения).
Женщины контрольной группы поступали в отделение эндоскопической хирургии для плановой хирургической стерилизации по социальным показаниям согласно приказа МЗ РФ №303 от 1993 года. Перед проведением оперативного вмешательства женщины данной группы обследовались в женских консультациях г. Иваново и Ивановской области, в консультативно-диагностической поликлинике НИИ МиД.
Женщины с наружным генитальным эндометриозом и трубно-перитонеальным фактором обследовались на специализированном приеме в КДП ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова»  Минздравсоцразвития России в отделении нарушений репродукции гинекологической клиники НИИ МиД. Учитывались результаты предыдущих исследований.
На каждую женщину заполнялась «Карта клинико-лабораторных исследований», в которую вносились данные анамнеза, обследования из истории болезни и амбулаторных карт, сведения о тактике ведения больных и исходах заболевания.
Материалом для исследования служили: перитонеальная жидкость, биоптаты эндометрия из полости матки и ткань эндометриоидных очагов. Забор биологического материала проводился в момент лапароскопии. Образцы исследуемого материала забирались в стерильные пробирки.
	В схему обследования входили общеклинические, электрофизиологические (УЗИ, ЭКГ), морфологические, иммунологические исследования.	
Иммунологические  методы:
- выделение популяции мононуклеарных клеток (МНК) перитонеальной жидкости  стандартным методом скоростного центрифугировании в градиенте плотности фиколл-верографина (d=1,078);
- определение экспрессии мембранных рецепторов перитонеальными макрофагами с помощью моноклональных антител анти-CD11b (ООО «Сорбент», Москва), CD49e (BD Boisceinces, USA), CD95 (Caltag Laboratories, USA), CD86, CD36 (Beckman Coulte, Francer) и CD204 (R&D Systems, USA) методом проточной цитометрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA). Анализ результатов проводили в программе "CellQuest Pro" (Becton Dickonson, USA).
-   определение экспрессии мРНК HSP27 в ткани эутопического и эктопического эндометрия методом количественной полимеразной цепной реакции (RT-PCR) в масштабе реального времени на амплификаторе с оптической насадкой iCycler iQ (BIO-RAD, USA). В работе использовали праймеры и зонды для HSP27 и 2-микроглобулина (ЗАО «Синтол», Москва, Россия);
- совместное культивирование in vitro эксплантов эутопического эндометрия женщин основных клинических групп наблюдения с обогащенной популяцией аутологичных перитонеальных макрофагов, или в присутствии аутологичной перитонеальной жидкости при 370С и 5% СО2 в течение 24 часов с последующим разделением эндометриальных фрагментов и макрофагов и определение уровня экспрессии мРНК HSP27 в эндометрии и уровня экспрессии мембранных рецепторов макрофагами;
- определение in vitro влияния ГМДП на функциональное состояние перитонеальных макрофагов женщин с наружным генитальным эндометриозом путем инкубирования обогащенной популяции макрофагов или совместной культуры макрофагов с аутологичным эндометрием в среде RPMI 1640, содержащей ГМДП в концентрации 2 мкг/мл, в течение 24 часов при 370С и 5% СО2  с последующем определении уровня экспрессии функциональных молекул макрофагами;
- определение in vitro влияния транспортной наносистемы, созданной на основе препарата ГМДП и диоксида кремния, на функцию перитонеальных макрофагов при наружном генитальном эндометриозе. В работе были использованы АПТЭС-модифицированные частицы кремнезема размером 100 и 200 нм. Синтез частиц был проведен в Учреждении Российской академии наук Институте химии растворов РАН в лаборатории «Химия гибридных нанокомпозитов и супрамолекулярных систем». Для оценки уровня клеток, реагирующих с наноразмерными частицами кремнезема, были синтезированы модифицированные частицы с иммобилизованными иммуноглобулинами овцы, мечеными флюоресецеинизотиоцианатом (FITC). При создании транспортной системы проводилась адсорбция ГМДП из раствора на поверхность частиц кремнезема за счет нековалентных электростатических и гидрофобных взаимодействий. Инкубировали обогащенную популяцию макрофагов, а также совместную культуру макрофагов с аутологичным эндометрием женщин с наружным генитальным эндометриозом в присутствии наноразмерной транспортной системы на основе кремнезема и ГМДП в течение 24 часов при 370С и 5% СО2 с последующем определении уровня экспрессии функциональных молекул макрофагами. 
	Морфологические методы
Производилась обзорная гистология. Оперативно удаленный материал фиксировался в 10%-ном нейтральном формалине в течение 72 часов. После стандартной парафиновой проводки готовились срезы толщиной 4-5 мкм, окрашивались гематоксилином Эрлиха с окраской эозином и заключались в бальзам. В обзорных препаратах изучалась межуточная ткань, сосудистое русло и мышечный компонент. В работе использовался микроскоп «Биолам» с бинокулярной насадкой АУ – 12 (ЛОМО).
Статистические методы исследования 
Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического с использованием программы Statistica 6.0. Достоверность различий показателей женщин с эндометриозом по сравнению с контрольной группой определялась по t-критерию Стьюдента. Пороговые значения уровня CD36+ и  CD204+макрофагов, характерные для наружного генитального эндометриоза, определяли с помощью ROC-анализа с использованием ROC-кривой (Receiver Operator Characteristic).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Под наблюдение были взяты пациентки репродуктивного возраста от 26-35 лет. Средний возраст составил 32,58±0,79 года в контрольной группе, 29,43±0,41 лет – в основной группе и 29,40±0,79 лет – в группе сравнения. Сравнительный анализ показателей среднего возраста в обследованных группах не имел достоверных отличий.
Средний возраст менархе и характер становления менструальной функции  не различались у обследованных женщин.  Нарушение менструального цикла по типу дисменореи встречалось у 50,00% женщин основной группы, что достоверно чаще, чем в контрольной группе (20,00%) и в группе сравнения (25,00%) (р<0,01 во обоих случаях).
Репродуктивная функция была реализована у 100% женщин контрольной группы. Роды в анамнезе были у 22% женщин основной группы и у 31% женщин группы сравнения. Одновременно в этих  группах наблюдения отмечался высокий процент женщин, не имевших в анамнезе беременности (56% и 22% соответственно), что достоверно отличает этих пациенток от группы контроля (p<0,001 во всех случаях). Общее количество абортов в основной  группе (19,00%) и группе сравнения (25,00%) достоверно ниже было по сравнению с контрольной  группой (74,29%, p<0,01и p0,001, соответственно). 
У всех женщин основной группы и группы сравнения на момент обследования было диагностировано бесплодие, при этом у женщин с наружным генитальным эндометриозом чаще отмечалось первичное бесплодие (56,00%). У женщин с трубно-перитонеальным фактором превалировало вторичное бесплодие (78,13%). Кроме того, у пациенток группы сравнения отмечалась высокая частота эктопических беременностей в анамнезе (37,50%), по сравнению с основной группой и группой контроля (p0,001, в обоих случаях). 
	Анализ данных гинекологического анамнеза показал, что у пациенток с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием в 12% случаев  отмечалась ранее произведенная деструкция очагов эндометриоза (p<0,001 в обоих случаях). Кроме того, для женщин основной группы (10,00%)  была характерна сниженная по сравнению с контрольной группой  (25,71%) частота выявления эктопий шейки матки (p<0,05). Отличительной чертой группы сравнения было наличие в анамнезе  реконструктивно-пластических операций на маточных трубах, а также туботомии и тубэктомии, и воспаления придатков матки.
	При изучении характера соматической патологии отмечено, что у женщин основной группы в анамнезе с высокой частотой отмечались аллергические реакции (23,00%), что достоверно отличало этих пациенток от женщин контрольной группы (5,71%) и группы сравнения (9,38%) (р<0,01 и р<0,05, соответственно). У женщин с трубно-перитонеальным бесплодием выявлена повышенная частота заболеваний мочевыделительной системы по сравнению с основной группой и группой контроля (15,63% случаев - в группе сравнения, 0%  случаев - в контрольной группе и  1% случаев - в основной группе,  p<0,05 и p<0,02 соответственно).
	В ходе проведения лапароскопической операции у всех женщин основной группы был выявлен наружный генитальный эндометриоз, что является отличительной чертой данной группы. По степени распространенности эндометриоидного процесса у женщин основной группы  наиболее часто встречалась II степень – в 77%, III и IV степень была выявлена у 20 % пациенток. У женщин группы сравнения в 100% случаев был диагностирован хронический сальпингит, который сочетался со спаечным процессов в малом тазу в 22% случаев (p<0,001). 
При изучении показателей функционального состояния перитонеальных макрофагов было установлено, что у женщин основной группы в перитонеальной жидкости было снижено содержание макрофагов, экспрессирующих на своей поверхности CD11b (72,83 ±2,29%) и CD86 молекулы (50,89 ±2,03%), по сравнению с группой контроля (CD11b+ - 85,21± 1,57%; CD86+ - 65,23 ±8,04%) (p<0,01 во всех случаях). Такие же изменения были выявлены и у пациенток группы сравнения (CD11b+ - 70,84 ±3,61%, p<0,01, CD86+- 47,13± 4,14, p<0,02). 
Известно, что низкий уровень экспрессии CD11b молекул свидетельствует об  угнетении опсонизированного фагоцитоза (Wu R., 2004). Нарушение функционирования CD86 рецепторов по данным литературы приводит к угнетению реакций адаптивного иммунитета, что часто ассоциируется с усилением реакций врожденного иммунитета (Seliger B., 2008). По-видимому, выявленные нами нарушения экспрессии CD11b и CD86 молекул могут отражать наличие локального хронического воспаления при нарушениях фертильности у пациенток с трубно-перитонеальным фактором и с наружным генитальным эндометриозом. 
	Только для женщин с эндометриозом, ассоциированным с бесплодием, было характерно угнетение экспрессии интегриновых молекул CD49e и так называемых «рецепторов-мусорщиков» CD36 и CD204 на поверхности перитонеальных макрофагов, по сравнению с контрольной группой  (CD49e – основная группа 80,15± 2,34%, контрольная группа -87,91 ±2,19%;  CD36 - основная группа - 57,76 ±1,93%, контрольная группа - 70,86± 9,22%; CD204 – основная группа 53,20 ±2,36%, контрольная группа - 68,31± 5,37%, p<0,01 во всех случаях).  Подобных изменений не было отмечено в группе сравнения, что позволяет сделать вывод о том, что эти нарушения не связаны с бесплодием, а определяются наличием эндометриоидных очагов в перитонеальной полости у женщин основной группы. 
Низкий уровень экспрессии CD49e молекул, являющихся рецепторами к фибронектину (Bowen J., 2000), на поверхности перитонеальных макрофагов женщин с наружным генитальным эндометриозом может вести к нарушению своевременного распознавания макрофагами аутологичных клеток, в том числе и клеток эктопического эндометрия. «Рецепторы-мусорщики» являются важнейшими функциональными рецепторами макрофагов, участвуя в осуществлении реакций фагоцитоза и способствуя удалению клеточного дебриса из перитонеальной полости (Moore K.J., Freeman M.W., 2006). Выявленное нами снижение экспрессии «рецепторов-мусорщиков» A и B типа перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом, может приводить к нарушению своевременной элиминации эндометриальных клеток из перитонеальной полости макрофагами.    
В эндометрии женщин основных клинических групп наблюдения мы оценили характер синтеза белков теплового шока - HSP27. При эндометриозе в эутопическом эндометрии уровень экспрессии мРНК HSP27 не отличался от такового у женщин контрольной группы и группы сравнения (контрольная группа - 0,230,05 копий парх104/мкл; основная группа - 0,220,08 копий парх104/мкл; группа сравнения - 0,410,19 копий парх104/мкл, p>0,05 во всех случаях). Однако  в ткани эндометриоидного очага экспрессия мРНК HSP27 значительно превышала этот показатель в эутопическом эндометрии пациенток с эндометриозом, а также в эндометрии здоровых женщин и женщин с трубно-перитонеальным бесплодием (1,750,55 копий парх104/мкл, p<0,01 во всех случаях). По данным литературы молекулы HSP27 обладают сильным  цитопротективным действием, подавляя  апоптоз (Javid B., 2007). Высокий уровень синтеза HSP27 в эктопическом эндометрии может быть важным механизмом, участвующим в формировании и росте эндометриоидного очага. Возможно, что высокий уровень экспрессии HSP27 в эктопическом эндометрии у женщин с наружным генитальным эндометриозом связан с факторами перитонеального микроокружения, которые непосредственно влияют на клетки эутопического эндометрия, попадающего в перитонеальную полость в результате менструального рефлюкса, усиливая их жизнеспособность и помогая им избегать атаки со стороны клеток иммунной системы. Для проверки этого предположения нами была проведена серия экспериментов in vitro. Мы культивировали экспланты эутопического эндометрия пациенток с эндометриозом в присутствии аутологичной перитонеальной жидкости или в присутствии обогащенной популяции перитонеальных макрофагов, после чего определяли уровень экспрессии в ткани эндометрия мРНК HSP27. Кроме того, в макрофагах после их взаимодействия с эндометрием оценивали уровень экспрессии функциональных молекул и «рецепторов-мусорщиков». 
По нашим данным, у женщин контрольной группы и группы сравнения как перитонеальные макрофаги, так и перитонеальная жидкость не влияли на уровень экспрессии мРНК HSP27 в эндометрии.  У пациенток с эндометриозом непосредственный контакт эндометриальных клеток с перитонеальными макрофагами также не приводил к существенным изменениям в экспрессии гена HSP27. Однако аутологичная перитонеальная жидкость стимулировала экспрессию мРНК HSP27 в ткани эндометрия по сравнению с таковой в эндометрии, культивировавшемся в тех же условиях только в культуральной среде RPMI 1640 (p<0,05). По-видимому, особенности цитокинового профиля перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом, в частности высокое содержание в ней провоспалительных цитокинов и факторов роста, вызывают изменения в ткани эндометрия, способствуя его эктопическому росту.  
При изучении ответа самих перитонеальных макрофагов на стимуляцию клетками эутопического эндометрия было установлено, что в контрольной группе и в группе сравнения наблюдались сходные изменения экспрессии поверхностных рецепторов макрофагами после их взаимодействия с эндометрием. У здоровых фертильных женщин мы отмечали достоверное усиление экспрессии CD36 (с 65,18 ±3,52% до  80,28±2,44%), и  CD204 молекул макрофагами (с 65,83 ± 2,58% до 75,10±1,00%) под действием аутологичного эндометрия  (p<0,05 во всех случаях). У женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в ответ на стимуляцию аутологичным эндометрием происходило повышение уровня CD36+ макрофагов (с 58,17 ±4,79% до 70,87 ±2,96%, p<0,001). Выявленное нами усиление экспрессии «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами здоровых женщин и женщин с трубно-перитонеальным бесплодием после их взаимодействия с аутологичным эндометрием, по-видимому,  является физиологичным и отражают нормальную реакцию макрофагов на эктопически перемещенный эндометрий. 
У  пациенток с наружным генитальным эндометриозом была выявлена другая направленность изменений экспрессии поверхностных рецепторов перитонеальными макрофагами после их взаимодействия в клетками аутологичного эндометрия. У женщин этой группы мы не отмечали каких-либо изменений в экспрессии «рецепторов-мусорщиков» на поверхности макрофагов после их контакта с аутологичным эндометрием. Одновременно после инкубации перитонеальных макрофагов женщин с эндометриозом с фрагментами эндометриальной ткани происходило снижение экспрессии интегриновых молекул CD11b (с 76,08 ±1,71% до 65,25± 3,64%) и CD49e (с 77,41± 1,89%  до 66,83± 3,51%) на клеточной мембране макрофагов (p<0,01 во всех случаях). 
По-видимому, измененные антигенные свойства ткани эндометрия и выявленные нами нарушения функционального состояния перитонеальных макрофагов при эндометриозе определяют отсутствие адекватного ответа макрофагов на стимуляцию клетками эндометрия. Данный феномен может лежать в основе механизмов эктопического роста эндометриальных клеток, позволяя им избежать атаки со стороны иммунной системы. Можно предположить, что поиск путей коррекции функции «клеток-мусорщиков» у перитонеальных макрофагов позволит разработать новые подходы к лечению наружного генитального эндометриоза и ассоциированного с ним бесплодия. 
Одним из препаратов, оказывающих влияние на клетки моноцитарно-макрофагальной системы, является глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП), входящий в состав препарата Ликопид. ГМДП относится к иммуномодуляторам микробного происхождения и является минимальным биологически активным компонентом пептидогликанов, входящих в состав клеточной стенки всех бактерий.  Для лечения женщин с наружным генитальным эндометриозом Ликопид ранее не применяли. В нашей работе мы в эксперименте in vitro оценили влияние ГМДП на функциональное состояние макрофагов женщин с эндометриозом. 
Было установлено, что после 24-часовой инкубации перитонеальных макрофагов женщин с наружным генитальным эндометриозом с ГМДП происходило достоверное увеличение по сравнению с показателями клеток, инкубировавшихся только в культуральной среде RPMI 1640, экспрессии макрофагами молекул CD36 (с 63,73 ±2,75% до 75,67 ±3,15%, p<0,01) и CD204 (с 55,11± 8,74% до 69,79±3,75 %, p<0,001). В тех случаях, когда препарат ГМДП добавляли в совместную культуру перитонеальных макрофагов с эутопическим эндометрием, мы выявили не только усиление экспрессии на поверхности макрофагов CD36 (с 63,73 ±2,75% до  76,06 ±3,21 %, p<0,05) и  CD204 молекул (с  55,11± 8,74% до 71,37± 3,61 %, p<0,01), но и  повышение экспрессии CD11b молекул (с 76,08 ±1,71% до 84,25± 1,70 %, p<0,001). Таким образом, ГМДП нормализовал не только изначально сниженную экспрессию «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами при эндометриозе, но и ответ макрофагов на специфическую стимуляцию клетками эндометрия. 
В нашей работе мы попытались разработать подход к топической доставке ГМДП непосредственно в макрофаги. Для этой цели в Институте Химии растворов РАН были синтезированы наноразмерыне частицы кремнезема, диаметром 100 и 200 нм. Иммобилизация на частицы иммуноглобулинов, меченных флюорохромной меткой, позволило провести количественный анализ различных типов клеток иммунной системы, реагирующих с наночастицами, используя проточную цитометрию. 
Культивирование макрофагов перитонеальной жидкости в присутствии наночастиц кремния различного размера не оказывало влияния на жизнеспособность  макрофагов. При оценке уровня активации макрофагов после их инкубации с наночастицами кремния было установлено, что после 1-часовой инкубации макрофагами с частицами кремнезема размером 200 нм происходило усиление экспрессии HLA-DR и CD204 молекул макрофагами, тогда как частицы размером 100 нм не оказывали влияния на уровень активации макрофагов. После 24-часового культивирования в присутствии наночастиц кремния размером 100 и 200 нм изменений в экспрессии функциональных молекул перитонеальными макрофагами отмечено не было. Был сделан вывод о том, что частицы более крупного размера могут приводить к нежелательной дополнительной активации макрофагов, поэтому в дальнейшем в эксперименте мы использовали только частицы размером 100 нм, которые не влияли на уровень активации клеток. 
Для определения степени специфичности реагирования наноразмерных частиц кремнезема с макрофагами мы провели сравнительный анализ реакции различных типов клеток иммунной системы (лимфоцитов и макрофагов) с исследуемыми наночастицами. Было установлено, что уровень лимфоцитов, реагирующих с наночастицами, был невелик и колебался от 0,1% до 2%. Перитонеальные макрофаги  более интенсивно реагировали с наночастицами кремнезема. После 1 часа совместного культивирования около 60% всех макрофагов характеризовались наличием на их мембране и/или во внутриклеточном пространстве частиц кремнезема. После 24 часового культивирования количество макрофагов, имеющих на мембране и/или во внутриклеточном пространстве частицы кремнезема, составляло более 90%. 
На следующем этапе наших исследований  на основе препарата ГМДП и диоксида кремния была создана наноразмерная транспортная система для топической доставки ГМДП в перитонеальные макрофаги. При создании транспортной системы проводилась адсорбция ГМДП из раствора на поверхность частиц кремнезема за счет нековалентных электростатических и гидрофобных взаимодействий. 
Направленный транспорт в макрофаги  ГМДП с помощью транспортной наносистемы приводил к усилению экспрессии «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами. Нами отмечалось увеличение экспрессии CD36 молекул перитонеальными макрофагами с 72,64 ±1,51% до 84,10 ±1,55% (p<0,004) и увеличение уровня CD204+ макрофагов с 56,60± 1,52% до 69,48±3,64% (p<0,01). Добавление транспортной наносистемы в совместную культуру перитонеальных макрофагов и клеток эндометрия приводило к повышению экспрессии на поверхности перитонеальных макрофагов не только SR рецепторов (CD36 молекул с 72,64 ±1,51% до 87,46 ±2,1%, p<0,001; CD204 молекул с 56,60± 1,52% до 74,30± 7,32%, p<0,05), но и CD11b молекул (с 77,56 ±2,89% до 87,96± 1,18%, p<0,02). При этом эффект, полученный при действии транспортной наносистемы, превышал таковой, выявленный для чистого препарата ГМДП. Таким образом, топическая доставка препарата ГМДП в перитонеальные макрофаги позволяет добиться максимального стимулирующего действия иммуномодулятора в отношении макрофагов. 
Обобщая полученные результаты можно заключить, что в основе иммунных механизмов формирования эндометриоидного очага лежит нарушение взаимодействия перитонеальных макрофагов с клетками эутопического эндометрия, связанное с угнетением функции «клеток-мусорщиков» у макрофагов и с усилением жизнеспособности клеток эндометриоидного очага из-за повышенного синтеза HSP27 молекул. Препарат ГМДП нормализует ответ перитонеальных макрофагов на стимуляцию клетками эндометрия при эндометриозе, что позволяет рекомендовать проведение дальнейших исследований по возможности применения ГМДП для лечения пациенток с наружным генитальным эндометриозом. 
ВЫВОДЫ
1.	У женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием, в отличие от пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, преобладает первичное бесплодие, нарушение менструальной функции по типу дисменореи, низкая встречаемость эктопий шейки матки и высокая - аллергических реакций. 
2.	У женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием отмечается нарушение функционального состояния перитонеальных макрофагов, характеризующееся угнетением экспрессии «рецепторов-мусорщиков» CD36, CD204 и интегриновых молекул CD49e, а также снижением содержания  CD11b+ и CD86+ макрофагов по сравнению с показателями женщин контрольной группы. Сниженное содержание CD11b+ и CD86+ макрофагов в перитонеальной жидкости характерно и для женщин с трубно-перитонеальным бесплодием. 
3.	У женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием уровень экспрессии мРНК HSP27 в ткани эктопического эндометрия превышает таковой в эутопическом эндометрии у пациенток этой группы, а также у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием и у здоровых фертильных женщин. Перитонеальная жидкость женщин с эндометриозом в опытах in vitro стимулирует экспрессию мРНК HSP27 клетками эутопического эндометрия. 
4.	Совместная инкубация in vitro перитонеальных макрофагов с тканью эутопического эндометрия у фертильных женщин приводит к усилению экспрессии CD36 и CD204 молекул на поверхности макрофагов, у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием – повышению уровня CD36+ макрофагов при отсутствии изменений в экспрессии интегриновых молекул. У женщин с наружным генитальным эндометриозом при взаимодействии перитонеальных макрофагов с эндометрием не происходит изменений экспрессии «рецепторов-мусорщиков», но снижается экспрессия интегриновых молекул CD11b и CD49e макрофагами. 
5.	Препарат ГМДП in vitro стимулирует экспрессию CD36 и CD204 молекул перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием. При добавлении ГМДП в совместную культуру перитонеальных макрофагов и тканевых эксплантов аутологичного эндометрия женщин с эндометриозом  усиливается экспрессия перитонеальными макрофагами не только «рецепторов-мусорщиков», но и интегриновых молекул  CD11b.  
6.	Наноразмерные частицы кремнезема диаметром 100 нм не влияют на жизнеспособность и функциональное состояние перитонеальных макрофагов. Транспортная наносистема на основе модифицированного кремнезема и ГМДП стимулирует экспрессию «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами в большей степени, чем чистый препарат ГМДП. 
Практические рекомендации
Разработанные нормативные значения показателей экспрессии «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами (CD36+ более 64,5% и CD204+ -  более 59,9%) рекомендуется использовать для оценки функционального состояния перитонеальных макрофагов.
Рекомендуется проведение дальнейшего исследования по применению препарата Ликопид  в комплексе лечебных мероприятий у женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием. 
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
Публикации в журналах, включённых в перечень изданий, рекомендованных ВАК РФ:
1.	Анциферова Ю.С., Сотникова Н.Ю., Посисеева Л.В., Елисеева М.А., Филиппова Е.С.  Иммунные механизмы, определяющие нарушение взаимодействия перитонеальных макрофагов с эутопическим эндометрием у женщин с наружным генитальным эндометриозом // Медицинская иммунология. - 2009.- т.11, №4-5.- С.400-401. 
2.	Филиппова Е.С., Елисеева М.А., Красильникова А.К./ Особенности регуляции инвазии и апоптоза клеток эутопического и эктопического эндометрия при эндометриозе// Ж. «Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии».-2010.- № 2/1 (29). -С.214.
3.	Анциферова Ю.С., Парфенюк Е.В., Красильникова А.К., Елисеева М.А., Куликова Г.А. Экспериментальное обоснование возможности регуляции ликопидом экспрессии «рецепторов-мусорщиков» на поверхности перитонеальных макрофагов у женщин с наружным генитальным эндометриозом // Ж. «Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии».-2010.- № 2/1 (29). -С.241.
Публикации в журналах, сборниках, 
материалах конференций и тезисы докладов:
1.	Antsiferova Yu.S., Sotnikova N.Yu., Posiseeva L.V., Filippova E.S., Eliseeva M.A. Immune mechanisms of endometriosis lesions formation//Abstracts book of 12th International Symposium for Immunology of Reproduction- Varna, Bulgaria, 2009.- P. 77-78.
2.	Kulikova G. A., Parfenyuk E.V., Ryabinina I.V., Antsiferova Y.S., Sotnikova N.Y., Posiseeva L.V., Eliseeva M.A.  
 In vitro studies of interaction of modified silica nanoparticles with
different types of immunocompetent cells //  
 Journal of Biomedical Materials Research.-2010.- Vol. 95A, issue 2, -
P.434-439.
3.	Елисеева М.А., Посисеева Л.В., Сотникова Н.Ю., Филиппова Е.С., Анциферова Ю.С. Изменение фенотипа и цитокинового профиля перитонеальных макрофагов при их взаимодействии с клетками эутопического эндометрия при наружном генитальном эндометриозе //  Проблемы репродукции.- 2009.- спец. выпуск.- С.179-180.
4.	Елисеева М.А., Посисеева Л.В., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С. Изменение экспрессии функциональных молекул на поверхности перитонеальных макрофагов при их взаимодействии с клетками эутопического эндометрия у женщин с наружным генитальным эндометриозом // Вестник Военно-Медицинской академии.- 2009.-№1(25).- С.697.
5.	Елисеева М.А., Посисеева Л.В., Сотникова Н.Ю., Кирсанов А.Н.,  Анциферова Ю.С. Характеристика функционального состояния перитонеальных макрофагов у женщин с бесплодием, ассоциированным с наружным генитальным эндометриозом и трубным фактором // Аллергология и иммунология. -2009.- т.10, №2.-  С.249-250.
6.	Сотникова Н..Ю., Анциферова Ю.С., Елисеева М.А., Парфенюк Е.В., Куликова Г.А. Характеристика взаимодействия частиц модифицированных кремнеземов с различными типами иммунокомпетентных клеток// Сборник тезисов. 1 Международной научной школы "Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах".- 29 июня-4 июля 2009, Москва.- С. 340-342
7.	Куликова Г.А., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Елисеева М.А. Разработка наноносителей лекарственного препарата для лечения эндометриоза // Сб. тезисов 13-й междунар. Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука 21 века».-Пущино, 2009.-С.169.
8.	Сотникова Н.Ю.,  Анциферова Ю.С., Посисеева Л.В., Елисеева М.А., Куликова Г.А., Парфенюк Е.В. Обоснование возможности создания новых лекарственных транспортных систем на основе  наночастиц модифицированного кремнезема для коррекции функции перитонеальных макрофагов у женщин с наружным генитальным эндометриозом // тезисы III всероссийской научно-практической конференции «Высокие медицинские технологии».- Москва, 2009.- С. 138.
9.	Елисеева М.А., Посисеева Л.В., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С. Исследование in vitro влияния иммуномодулятора ликопид на экспрессию функциональных рецепторов перитонеальными марофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом // сб. науч. тр. и материалов науч.-практ. конф. «Современные перинатальные медицинские технологии в решении проблем демографической безопасности».- 2009, г.Минск.- с.151-155.
10.	Елисеева М.А. Особенности экспрессии рецепторов-мусорщиков перитонеальными макрофагами при их взаимодействии с аутологичным эндометрием при наружном генитальном эндометриозе // Материалы 89й ежегодной научно-практической конференции молодых ученых ИвГМА, посвященной 120летию со дня рождения профессора Н.М. Иценко. «Неделя науки – 2009».-20-25 апреля 2009,Иваново.- С.20. 
11.	Анциферова Ю.С., Сотникова Н.Ю., Малышкина А.И., Шаалали Ю.С., Елисеева М.А. Иммунные нарушения при эндометриозе и новые подходы к их коррекции// Сб.тезисов XIII Международного конгресса с курсом эндоскопии «Новые технологи в диагностике и лечении гинекологических заболеваний».- Москва, 2010.-С.153-154.
12.	Анциферова Ю.С., Сотникова Н.Ю., Елисеева М.А., Филиппова Е.С. Особенности регуляции апоптоза в эутопическом и эктопическом эндометрии у женщин с эндометриозом // Jurnali nazariy va klinik tibbiyot (Журнал теоретической и клинической медицины, Узбекистан).- 2010.- №5.- С. 71-74.
Список сокращений
CD – кластер дифференцировки
HSP – белок теплового шока
ГМДП - глюкозаминилмурамилдипептид
МНК – мононуклеарные клетки
УЗИ – ультразвуковое исследование 
ЭКГ - электрокардиограмма 
мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота