На правах рукописи

ШААЛАЛИ ЮЛИЯ СЕРГЕЕВНА

ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ С ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ЖЕНЩИН С БЕСПЛОДИЕМ, ОБУСЛОВЛЕННЫМ «МАЛЫМИ» ФОРМАМИ НАРУЖНОГО ГЕНИТАЛЬНОГО ЭНДОМЕТРИОЗА

14.01.01 – акушерство и гинекология

Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук

Иваново 2010
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» 
Научные руководители: 
доктор медицинских наук	                Малышкина Анна Ивановна
доктор биологических наук                   Анциферова Юлия Станиславовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор 
(ГУЗ «Московский областной 
 перинатальный центр»)                        Серова Ольга Федоровна	

доктор медицинских наук, профессор
(ГОУ ВПО «Нижегородская
государственная медицинская
академия Росздрава»                                Качалина Татьяна Симоновна	

Ведущая организация – Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская медицинская академия им. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита диссертации состоится «__» июля 2010 года в «_____» часов на заседании диссертационного совета Д 208.028.01 при Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» по адресу: 153045, Россия, г. Иваново, ул. Победы, 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Ив НИИ М и Д              им. В.Н. Городкова Росмедтехнологий».

Автореферат разослан «____ » мая 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета 
доктор медицинских наук			                                 И.А.Панова 

Актуальность научного исследования
Проблема восстановления репродуктивной функции у больных с бесплодием при наружном генитальном эндометриозе в настоящее время имеет особую актуальность (Бурлеев В.А., и др. 2009). По данным разных авторов, наружный генитальный эндометриоз встречается более чем у 50% женщин с бесплодием (Кулаков В.И., и др. 2001; Hever A. et al., 2007). Однако причины, вызывающие развитие бесплодия у женщин с  наружным генитальным эндометриозом, все еще до конца не установлены. Особый интерес представляет бесплодие, ассоциированное с «малыми» формами наружного генитального эндометриоза. До сих пор нет единого мнения о том, почему у этих больных развивается бесплодие при минимальных анатомических изменениях органов  малого таза (Марченко Л.А., 2007). 
На сегодняшний день существует несколько патогенетических теорий эндометриоза и ассоциированного с ним бесплодия. Нарушения в иммунной системе занимают одно из ведущих мест среди всего многообразия концепций (Ярмолинская М.И., 2008). По мнению многих авторов, наружный генитальный эндометриоз может рассматриваться как аутоиммунное состояние, так как при данном заболевании усилена активация В-лимфоцитов, продукция ЦИК, выработка аутоантител (Анциферова Ю.С., и др. 2007; Tomassetti C., et al. 2006; Ulcova-Gallova Z., et. al. 2002;  Randall G.W, Bush S., Gantt P.A., 2009). Среди аутоантител встречаются такие, как антитела к фосфолипидам, эндометрию и сперматозоидам (Tomassetti C., et al. 2006). Известно, что активация В-лимфоцитов, способных к продукции ими антител, находится под контролем цитокинов IL-4, IL-5, IL-6, и др. (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008), однако особенности синтеза и продукции этих цитокинов у женщин с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза остаются пока недостаточно изученными. 
До настоящего времени не сложилось единого мнения о тактике ведения пациенток с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза. Большинство отечественных специалистов при лечении бесплодия отдают предпочтение комбинированной терапии: проведение лапароскопии на первом этапе лечения с целью хирургического удаления очагов и назначение гормональной терапии в качестве второго этапа терапии (Кира Е.Ф., и др. 2004). Однако вопрос о применении гормональных препаратов при «малых» формах наружного генитального эндометриоза остается дискуссионным (Rossmanith W.G., 2009). В последнее время в литературе появились сообщения о применении иммуномодуляторов в лечении эндометриоза, таких как циклоферон, реаферон, виферон, ронколейкин (Ярмолинская М.И., 2007; Колесникова Н.В. и др., 2008; Крутова В.А и др., 2008). Однако в большинстве случаев данное лечение применялось не с целью восстановления фертильности, а для уменьшения роста эндометриоидных гетеротопий и/или купирования болевого синдрома. Поэтому поиск эффективной иммуномодулирующей терапии, направленной на преодоление бесплодия у данного контингента пациенток является актуальным направлением исследований в современной гинекологии.
Цель исследования:
Обосновать возможность применения препаратов Аколат и Пентоксифиллин в комплексном лечении бесплодия у женщин с «малыми» формами наружного генитального эндометриоза  на основании изучения их влияния  на иммунологические параметры, характеризующие активность реакций гуморального звена иммунитета.
Задачи исследования:
1.	Дать характеристику соматического и репродуктивного здоровья женщин с бесплодием, ассоциированным с «малыми» формами наружного генитального эндометриоза.
2.	Выявить особенности содержания различных популяций В-лимфоцитов, TCRγδ+ лимфоцитов и продукции цитокинов 2 типа на системном уровне у женщин с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза.
3.	В эксперименте in vitro провести сравнительный анализ влияния препаратов Аколат и Пентоксифиллин на уровень внутриклеточной продукции цитокинов 2 типа лимфоцитами периферической крови здоровых фертильных женщин и женщин с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза.
4.	Оценить динамику иммунологических показателей, характеризующих активность реакций гуморального звена иммунитета у женщин с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза женщин до и после курса лечения препаратом Пентоксифиллин в раннем послеоперационном периоде.
5.	Оценить эффективность применения препарата Пентоксифиллин на основании динамического наблюдения за восстановлением репродуктивной функции пациенток. 
Научная новизна исследования
Впервые показано, что в основе аутоиммунных нарушений у женщин с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза  лежит увеличение циркулирующего пула TCRγδ+ лимфоцитов и активация В-1 лимфоцитов, ассоциированные с усилением синтеза и продукции цитокинов 2 типа (IL-4, IL-5 и IL-6) лимфоцитами периферической крови. 
Впервые выявлено, что препарат Аколат in vitro снижает внутриклеточную продукцию IL-5 у здоровых женщин и приводит к уменьшению внутриклеточной продукции IL-4, IL-5 и IL-6 в общей популяции  лимфоцитов и в популяции CD4+ клеток у женщин с бесплодием, обусловленным «малыми» формами наружного генитального эндометриоза. 
Установлено, что инкубация лимфоцитов периферической крови здоровых женщин с препаратом Пентоксифиллин снижает внутриклеточную продукцию IL-4 в популяции Т-хелперов и продукцию IL-6 в общей популяции лимфоцитов, при воздействии in vitro препарата Пентоксифиллин на лимфоциты женщин с эндометриозом и бесплодием происходит угнетение внутриклеточной продукции IL-4, IL-5 и IL-6 в общей популяции лимфоцитов и уменьшается уровень CD4+IL-4+ и CD4+IL-6+ клеток.
Впервые показано, что после проведения лечебно-диагностической лапароскопии у женщин с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза независимо от вида терапии, применяемой в раннем послеоперационном периоде, нормализуется содержание В-1 клеток, HLA-DR+ лимфоцитов, а также синтез и продукция IL-5 и IL-6.
Впервые выявлено, что применение Пентоксифиллина в раннем послеоперационном периоде у женщин с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза приводит к снижению циркулирующего пула TCR+ лимфоцитов, снижению синтеза, внутриклеточной продукции и сывороточного содержания IL-4, тогда как при традиционном ведении послеоперационного периода нормализации синтеза и продукции IL-4 не происходит. 
Установлено, что восстановление репродуктивной функции у женщин с бесплодием и «малыми» формами наружного генитального эндометриоза после курса терапии Пентоксифиллином в среднетерапевтических дозах по общепринятым схемам в раннем послеоперационном периоде ассоциировано с повышением уровня HLA-DR+ лимфоцитов и уменьшением содержания IL-5+ и CD4+IL-5+ лимфоцитов после лечения относительно исходного уровня данных показателей. 
Практическая значимость результатов исследования
Даны рекомендации по ведению женщин с бесплодием, обусловленным «малыми»  формами наружного генитального эндометриоза: в дополнение к общепринятой терапии в раннем послеоперационном периоде целесообразно проводить курс введения Пентоксифиллина внутривенно капельно в течение 5 дней, по 100 мг в сутки, затем per os по 800 мг в сутки  в течение 5 дней с целью нормализации показателей гуморального звена иммунитета и восстановления репродуктивной функции. 
Выявленное in vitro иммуномодулирующее действие препарата Аколат, направленное на нормализацию системной продукции цитокинов 2 типа, позволяет рекомендовать проведение дальнейшего изучения возможности использования этого препарата в лечении бесплодия у женщин с «малыми» формами наружного генитального эндометриоза. 
Гинекологической практике предлагается использовать новую медицинскую технологию «Прогнозирование эффективности хирургического лечения бесплодия у женщин с наружным генитальным эндометриозом» (находится на рассмотрении в Федеральной службе по надзору в сфере Здравоохранения и социального развития).
Положения, выносимые на защиту
Для женщин с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза характерно усиление аутоиммунных процессов в результате нарушения синтеза и продукции цитокинов 2 типа. 
Препараты Аколат и Пентоксифиллин in vitro снижают внутриклеточную продукцию IL-4, IL-5 и IL-6 периферическими лимфоцитами у женщин с бесплодием, обусловленным «малыми» формами наружного генитального эндометриоза. 
Использование препарата Пентоксифиллин в раннем послеоперационном периоде способствует восстановлению репродуктивной функции пациенток с «малыми» формами наружного генитального эндометриоза за счет нормализации продукции цитокинов, участвующих в развитии реакций гуморального звена иммунитета.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); IV съезде акушеров-гинекологов России (Москва, 2008); Х Форуме «Мать и дитя» (Москва, 2009); III Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва 2009); Конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора, Заслуженного деятеля науки РФ, Заслуженного врача РФ В.Н. Городкова (Иваново,2009); ХIII Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии» (Санкт-Петербург, 2009); VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009); IV Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2010); Конференциях молодых ученых «Неделя науки» ИвГМА (Иваново, 2008, 2009, 2010), Конференции молодых ученых, посвященной 30-летнему юбилею со дня основания института (Иваново, 2010). 
Внедрение результатов работы в практику
Новая медицинская технология «Прогнозирование эффективности хирургического лечения бесплодия у женщин с наружным генитальным эндометриозом» прошла предрегистрационные испытания в гинекологической клинике ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства имени В.Н.Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи ».
Препарат Пентоксифиллин включен в протокол ведения раннего послеоперационного периода у женщин с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза в гинекологической клинике ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства имени В.Н.Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи».
Личное участие автора
Самостоятельно проводились отбор пациенток в группы, согласно критериям включения и исключения, обследование и лечение пациенток. Принимала участие в проведении иммунологических исследований и постановке эксперимента. Была проведена систематизация, статистическая обработка, анализ и описание полученных результатов.  
Публикации
По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе – 6 в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и практические рекомендации. Библиографический указатель включает 217 источников, в том числе 70 отечественных и 147 иностранных источников. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 6 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования 
Исследование проведено на базе Федерального государственного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (директор д.м.н. - А.И. Малышкина). Исследования проводились в гинекологической клинике, на базе отделения эндоскопической хирургии (зав. отд., к.м.н. - В.Н. Романов), лаборатории клинической иммунологии (зав. лаб., д.м.н., профессор - Н.Ю. Сотникова). Всего было обследовано 100 женщин: 30 здоровых фертильных женщин репродуктивного возраста (контрольная группа), 70 женщин с бесплодием, обусловленным «малыми» (I-II степень по классификации Американского общества фертильности, 1985 год) формами наружного генитального эндометриоза (основная группа). Женщины контрольной группы поступали в отделение эндоскопической хирургии с целью добровольной хирургической стерилизации по социальным показаниям согласно приказу МЗ РФ №303 от 28.12.1993 года. Перед проведением оперативного вмешательства женщины основной группы обследовались в женских консультациях г. Иваново и Ивановской области, в консультативно-диагностической поликлинике и Центре планирования семьи и репродукции ИвНИИ МиД. В зависимости от технологии ведения раннего послеоперационного периода женщины основной группы методом случайного выбора были разделены на две подгруппы. 30 женщин (I подгруппа) в раннем послеоперационном периоде получали препарат Пентоксифиллин (регистрационный №015 494/01). Пентоксифиллин применялся внутривенно капельно, в течение 5 дней, по 100 мг в сутки, затем per os по 400 мг/2 раза в сутки  в течение 5 дней. Курсовая доза Пентоксифиллина составила 4500 мг, согласно стандарту оказания высокотехнологичной медицинской помощи женщинам с наружным генитальным эндометриозом III-IV степени (Сборник стандартов оказания дорогостоящей (высокотехнологичной) медицинской помощи, 2006). 40 женщин (II подгруппа) с традиционным ведением послеоперационного периода (антибактериальная и обезболивающая терапия по общепринятым схемам), не получали терапию препаратом Пентоксифиллин. Обследование женщин проводилось дважды: при поступлении в стационар для проведения хирургического лечения и через 1 месяц после лечения. Для оценки исхода лечения динамическое наблюдение за  женщинами основной группы проводилось в течение одного года после лапароскопии. Материалом для исследования служили: гепаринизированная периферическая венозная кровь и сыворотка, которые забиралась в день операции, непосредственно перед проведением основного оперативного вмешательства; биоптаты эндометрия получали одновременно с  проведением оперативного вмешательства. В схему обследования входили общеклинические, электрофизиологические (ультразвуковое исследование, электрокардиограмма), морфологические, иммунологические исследования.
Клинические методы
Клинические методы исследования включали сбор анамнеза, общий и гинекологический осмотр, лабораторные исследования, необходимые для выполнения оперативного вмешательства (общий анализ крови и мочи, биохимический анализ крови, коагулограмма, определение группы крови и резус-фактора, реакции Вассермана, серологической реакции на выявление ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С, мазки на флору, степень чистоты).

Иммунологические  методы исследования:
-Процедура выделения лимфоцитов из периферической крови  
Выделение обогащенной популяций лимфоцитов из периферической крови осуществляли стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (d=1,078).
-Проточная цитометрия
Поверхностный фенотип иммунокомпетентных клеток и внутриклеточную экспрессию ими цитокинов определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) методом двухцветной проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA). В качестве флюорохромной метки использовали флюоресцеин изотиоционат и фикоэритрин). В исследовании использовали следующие мАТ: анти-CD20, CD5, TCRγδ, HLA-DR, CD4 антитела (КлоноСпектр, Москва). Внутриклеточную продукцию цитокинов оценивали с помощью следующих мАТ: анти-human-IL-4, анти-human-IL-5 и анти-human-IL-6 антитела (CALTAG Laboratories, USA). Внутриклеточную процедуру окрашивания проводили в соответствии с инструкциями фирмы-производителя, используя коммерческий набор FIX & PERM cell permeabilization kit (CALTAG Laboratories, Burlingame, CA, USA) для пермеабилизации клеточной мембраны.
-Проведение количественной ПЦР в масштабе реального времени
Для количественного определения экспрессии мРНК IL-4, IL-5 и IL-6  в лимфоцитах периферической крови использовали метод полимеразной цепной реакции (PCR) в масштабе реального времени. При проведении RT-PCR применяли праймеры и зонды для IL-4, IL-5, IL-6 и 2-микроглобулина, который использовали в качестве гена домашнего хозяйства. Праймеры и зонды были синтезированы в лаборатории генной инженерии гематологического научного центра РАМН (г. Москва, зав. лабораторией Мисюрин А.В.) с применением программного обеспечения Vector NTI Advance 10  (Invitrogen, USA). Для полуколичественной оценки результатов RT-PCR, уровень экспрессии мРНК цитокинов лимфоцитами периферической крови женщин основной клинической группы  нормализовали относительно соответствующих показателей в контрольной группе и рассчитывали коэффициент RQ (related quantity) по стандартной формуле (Velden van V.H.J. 2003). Полученные результаты представлены как n-кратные различия между соответствующими показателями здоровых женщин  и женщин с эндометриозом и бесплодием.
Проведение иммуноферментных исследований 
Содержание IL-4 и IL-6 в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) на микропланшетном ридере Multiscan EX (Labsystems, Finland) с использованием коммерческих тест-систем производства Bender Medsystems (Austria).
Морфологические методы
Производилась обзорная гистология. Оперативно удаленный материал фиксировался в 10%-ном нейтральном формалине в течение 72 часов. После стандартной парафиновой проводки готовились срезы толщиной 4-5 мкм, окрашивались гематоксилином Эрлиха с докраской эозином и заключались в бальзам. В обзорных препаратах изучалась межуточная ткань, сосудистое русло и мышечный компонент. В работе использовался микроскоп «Биолам» с бинокулярной насадкой АУ – 12 (ЛОМО).
Статистические методы исследования 
Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программы «Statistica 6.0 for Windows». 
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Женщины с бесплодием, обусловленным «малыми» формами наружного генитального эндометриоза отличались от женщин контрольной группы отягощенным гинекологическим и репродуктивным анамнезом. Пациентки основной группы характеризовались более частыми - 21,43% самопроизвольными выкидышами в анамнезе, по сравнению со здоровыми женщинами (6,67%, р<0,05). Полученные нами данные согласуется с имеющимися литературными данными. Так, в работах различных авторов указано, что частота самопроизвольного прерывания беременности (чаще в 1-м триместре) у женщин с наружным эндометриозом колеблется от 10 до 50% (Ярмолинская М.И., Сельков С.А., 2007). Многие исследователи считают, что около 80% необъяснимых репродуктивных потерь связаны с иммунологическими нарушениями. (Радзинский К.В. и др., 2006). Нарушение менструального цикла по типу альгоменореи встречалось у 55,71% женщин основной группы, что достоверно выше, чем у женщин контрольной группы - 13,33% , (р<0,001). По мнению ряда авторов, нарушение менструальной функции при эндометриозе может являться одной из причин обращения женщин к гинекологу (Андреева Е.Н., 1997; Сметник В.П. 2002.; Mahmood T.A., Templeton A. 1991). 
В общесоматическом анамнезе отмечались более частые простудные заболевания – у 65,71% (р<0,001), и аллергические реакции – у 25,71% (р<0,001), по сравнению с контрольной группой. Многими авторами показано, что у женщин с наружным генитальным эндометриозом гораздо чаще, чем в основной популяции женщин репродуктивного возраста, встречаются различные аутоиммунные заболевания, такие как аллергические реакции, ревматоидный артрит, псориаз, бронхиальная астма и др. (Inagaki J., et al., 2003.; Iwasaki K., et al.,1993; Mathur S.P.  2000.; Oosterlynck D.J., et al. 1991.; Vigano P., et al. 1991; Sinaii N., et al. 2002). 
При обследовании у пациенток основной группы достоверно чаще (68,42%), чем в контрольной (0%) группе, выявлялись гиперпластические процессы эндометрия (р<0,01). Полученные нами данные, согласуются с литературными данными, согласно которым, значительное количество пациентов с наружным генитальным эндометриозом страдают полипозом и гиперплазией эндометрия (Баскаков В.П., 1990)
Есть мнение, что нарушение репродуктивной функции пациенток с наружным генитальным эндометриозом может быть напрямую связано с усилением активности аутоиммунных реакций при эндометриозе (Gazvani R., Tempelton A. 2002). В нашем исследовании мы оценили активацию различных популяций В-лимфоцитов и изучили особенности синтеза и продукции цитокинов 2 типа, контролирующих продукцию антител, у женщин основной клинической группы наблюдения. 
Нами было установлено, что у бесплодных женщин с наружным генитальным эндометриозом не отмечалось значительных изменений содержания общего пула В-лимфоцитов, однако у них был повышен уровень периферических В-1 лимфоцитов, имеющих фенотип CD20+CD5+ (1,65±0,16% – в контрольной группе, 2,6±0,19% – в основной группе, p<0,02). Известно, что В-1 лимфоциты продуцируют антитела низкой аффинности, которые могут реагировать с антигенами собственного организма (Murakami M., Honjo T., 1995).  Эти свойства В-1 лимфоцитов определяют их участие в развитии аутоиммунных заболеваний (Nothnick W.B., 2001). Вероятно, повышенное содержание этих клеток в периферической крови женщин с наружным эндометриозом может быть напрямую связано нарушением репродуктивной функции у данного контингента пациенток. 
Также у женщин основной группы было снижено содержание в HLA-DR+ лимфоцитов периферической крови (9,55±0,45%) по сравнению со здоровыми женщинами (12,01±0,63%, р<0,01). Известно, что HLA-DR молекулы экспрессируются на Т-лимфоцитах при их активации, отражая вступление клетки в поздние этапы активации. Кроме того, HLA-DR молекулы экспрессируются на поверхности В-лимфоцитов, вовлекаясь в осуществление межклеточного взаимодействия В- и Т-лимфоцитов (Ярилин А.А., 1999). Установленное нами изменение может свидетельствовать о нарушении процессов презентации антигенов клетками иммунной системы при эндометриозе.
Нами было выявлено значительное увеличение содержания в периферической крови женщин основной группы циркулирующего пула Т-лимфоцитов, несущих Т-клеточный рецептор γδ типа, или, так называемых γδТ клеток по сравнению с контролем (3,56±0,43% - контрольная группа, 6,04±0,49% - основная группа, p<0,02). Показано, что повышение активности TCR+ Т- лимфоцитов у человека ассоциируется с высоким титром аутореактивных антител (Brandes M.,. et al, 2003). Поэтому повышение уровня TCR+ Т- лимфоцитов у женщин основной группы можно расценивать как один из факторов, определяющих усиление продукции аутоантител и нарушением фертильности при эндометриозе.
Изучение продукции цитокинов дает нам важную информацию о состоянии иммунной системы. Известно, что цитокины, вырабатываемые Т-хелперами 2 типа, такие как IL-4, IL-5, IL-6 напрямую активируют В-лимфоциты и В-1 клетки (Симбирцев А.С., 2004). По нашим данным у женщин основной клинической группы наблюдения отмечалось усиление экспрессии периферическими лимфоцитами мРНК IL-4, IL-5 IL-6 по сравнению с аналогичными показателями женщин контрольной группы. 
У женщин основной группы нами отмечалось повышение внутриклеточной продукции периферическими лимфоцитами IL-4 (8,20±0,47% – в основной группе, 4,69±0,33% – в контрольной, p<0,001), IL-5 (9,92±0,68% – в основной группе, 5,67±0,78% – в контроле, р<0,01) и IL-6 (8,99±0,41% – в основной группе, 5,56±0,13% – в контроле, р<0,001). Наряду с этим происходило увеличение содержания Th2 лимфоцитов с фенотипом CD4+IL-4+ (3,61±0,26% – в основной группе, 2,28±0,18% – в контрольной, p<0,001)  и CD4+IL-6+ клеток (4,13±0,23% – в основной группе, 2,92±0,19% – в контрольной группе,  p<0,01). Кроме того, мы выявили повышение  сывороточного уровня IL-4 (0,59±0,23 пг/мл) и IL-6 (0,18±0,06 пг/мл) у женщин основной группы по сравнению с аналогичными показателями у здоровых фертильных женщин (р<0,05 и р<0,02 соответственно). Таким образом, отличительной характеристикой женщин с наружным генитальным эндометриозом являлось усиление гуморальных иммунных реакций, обусловленное увеличением синтеза, продукции и сывороточного содержания цитокинов Th2 типа.
Для определения возможности медикаментозной коррекции выявленных иммунных нарушений и продукции цитокинов при эндометриозе мы провели эксперимент по изучению in vitro влияния иммуномодулирующих препаратов Аколат и Пентоксифиллин на уровень внутриклеточной продукции IL-4, IL-5 и IL-6 лимфоцитами периферической крови. Выбор именно этих препаратов был обусловлен тем, что по данным литературы они влияют на продукцию цитокинов 2 типа (Jufaru I. Abu  et al. 2000; Mohammadzadeh A, et al. 2008). Проводилась инкубация лимфоцитов периферической крови здоровых фертильных женщин или женщин основной группы с этими препаратами в течение 24 часов, после чего мы определяли уровень внутриклеточной продукции цитокинов. У здоровых женщин Аколат снижал внутриклеточную продукцию IL-5 (с 7,73±0,64% до 5,33±0,9%, р<0,02), а Пентоксифиллин - IL-6 (с 7,6±0,94% до 4,86±0,53%, р<0,05). Оба препарата угнетали продукцию IL-4 Т-хелперами (с 2,62±0,42% до 1,42±0,22% – Пентоксифиллин, р<0,05; с 2,62±0,42% до 1,40±0,27% – Аколат, р<0,05). При воздействии на лимфоциты пациенток с эндометриозом угнетающее действие обоих препаратов  на продукцию цитокинов 2 типа было более выраженным. Причем Аколат в большей степени угнетал продукцию IL-5 как в общей популяции лимфоцитов, так и в популяции Т-хелперов. 
Таким образом, в эксперименте in vitro препараты Аколат и Пентоксифиллин вызывали снижению уровня продукции лимфоцитами цитокинов Th2 типа. Это позволило нам предположить, что при использовании  in vivo  этих препаратов у пациенток с бесплодием и эндометриозом будет нормализоваться изначально нарушенная продукция цитокинов 2 типа. 
В связи с этим, мы оценили действие Пентоксифиллина in vivo, включив его в курс послеоперационной терапии пациенток с бесплодием и малыми формами наружного генитального эндометриоза. Ранее данный препарат был рекомендован к использованию в раннем послеоперационном периоде при III-IV степени наружного генитального эндометриоза (Сборник стандартов оказания дорогостоящей (высокотехнологичной) медицинской помощи.,2006). 
Все женщины основной группы методом случайного выбора были разделены на две подгруппы. Женщины 1-й подгруппы в раннем послеоперационном периоде в дополнение к традиционному лечению получали курс терапии препаратом Пентоксифиллин по 4500мг. Женщины 2-й подгруппы получали традиционную терапию в раннем послеоперационном периоде. Через 1 месяц после лечения женщинам обеих подгрупп проводилось повторное иммунологическое обследование. 
Вне зависимости от вида получаемой терапии,  у женщин с эндометриозом через 1 месяц после лечения отмечалась нормализация содержания периферических В-1 клеток (с 2,69±0,19% до 2,13±0,31% – в 1-й подгруппе, с 2,53±0,31% до 2,08±0,29% во 2-й подгруппе) и  HLA-DR+ лимфоцитов (с 10,17±0,6% до 10,73±0,81% – в 1-й подгруппе, с 9,0±0,65% до 11,57±0,87%, во 2-й подгруппе). Однако, если после терапии Пентоксифиллном мы отмечали достоверное снижение TCRγδ+ лимфоцитов (с 5,26±0,57% до 3,47±0,46%, р<0,01), то при традиционной терапии этот показатель оставался повышенным (до лечения - 6,76±0,76%, после лечения  - 6,36±1,17%, р>0,05). Кроме того, у женщин этой подгруппы усиливалась активация В-лимфоцитов. Независимо от вида, терапии мы отмечали снижение экспрессии мРНК IL-5 (с 15,9±8,79 до 0,59±0,47 – в 1-й подгруппе, с 28,06±12,0 до 1,65±1,07 – во 2-й подгруппе)  и IL-6 (с 4,19±1,39 до 2,08±1,91 в 1-й подгруппе, с 4,48±1,92 до 0,43±0,43 – во 2-й подгруппе) периферическими лимфоцитами. Но у женщин, получавших Пентоксифлиин, одновременно происходило снижение экспрессии мРНК IL-4 (с 2,8±1,33 до 1,34±1,0), тогда как при традиционной терапии уровень экспрессии этого гена не только не снижался, но даже повышался по сравнению с исходным уровнем (с 3,21±1,24 до 19,5±9,9). Внутриклеточная продукция всех изученных цитокинов достоверно снизилась у женщин, получавших Пентоксифиллин. Так у женщин первой подгруппы нами отмечалась снижение содержания лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих внутриклеточно IL-4 (с 8,68±0,64% до 5,0±0,4%, р<0,001), IL-5 (с 10,38±0,8% до 7,13±0,82%, р<0,02) и IL-6, (с 9,75±0,56% до 7,0±0,43%, р<0,001) по сравнению с аналогичными показателями до лечения. В популяции Т-хелперов у женщин первой подгруппы, было выявлено, что после лечения Пентоксифилином достоверно снизилось содержание клеток с фенотипом CD4+IL4+ (с 3,54±0,31% до 2,5±0,25%, р<0,05)  и CD4+IL6+ (с 4,29±0,28% до 3,0±0,29%, р<0,001) по сравнению с аналогичными показателями до лечения. Подобного эффекта не отмечалось при традиционном лечении. Только после терапии Пентоксифиллином мы отмечали достоверное снижение сывороточного содержания IL-4 (с 0,58±0,25 пг/мл до 0,008±0,008 пг/мл, р<0,05). После традиционного лечения сывороточный уровень IL-4 и IL-6  не изменялся, (р>0,05 в обоих случаях). 
Таким образом, после терапии препаратом Пентоксифиллин у пациенток с бесплодием и эндометриозом отмечалась нормализация практически всех иммунологических показателей, характеризующих активность гуморальных иммунных реакций.
Наблюдение за восстановлением репродуктивной функции пациенток в течение 1 года показало, что в 1-й подгруппе, при терапии Пентоксифиллином беременность наступила у  36,7% женщин. Во второй подгруппе беременность наступила лишь у 20% женщин. Пациенткам не назначалась терапия аналогами гонадотропин – рилизинг  гормона и не проводились вспомогательные репродуктивные технологии. Таким образом, использование Пентоксифиллина в раннем послеоперационном периоде приводило к повышению частоты наступления беременности у женщин с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза в 1,84 раза чаще, по сравнению с традиционной терапией.
Эффективность различных видов терапии зависела от особенностей иммунореагирования пациенток. Наступление беременности у женщин с традиционным лечением происходило преимущественно в тех случаях, когда у пациенток отмечалось нормальное или низкое (2,6% или менее) содержание В-1 лимфоцитов в периферической крови.  При индивидуальном анализе данных было выявлено, что показатель содержания В-1 лимфоцитов, равный или менее 2,6% позволяет прогнозировать эффективность хирургического лечения бесплодия у женщин с «малыми» формами эндометриоза с точностью 77%. Полученные нами данные легли в основу разработанной медицинской «Прогнозирование эффективности хирургического лечения бесплодия у женщин с наружным генитальным эндометриозом».
Эффективность использования Пентоксифиллина в лечении бесплодия у женщин с эндометриозом зависела от индивидуального ответа иммунной системы на лечение. Так, нами было установлено, что после терапии препаратом Пентоксифиллин у женщин наблюдалось наступление беременности в тех случаях, когда при всех вышеперечисленных изменениях показателей гуморального звена иммунитета дополнительно отмечалось увеличении содержания HLA-DR позитивных лимфоцитов, снижении уровня IL-5+ клеток в общей популяции лимфоцитов и в популяции Т-хелперов  относительно исходного уровня. Т.е. позитивное действие Пентоксифиллина на репродуктивную функцию женщин отмечалось при максимально выраженной реакции со стороны иммунной системы. 
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о необходимости дифференцированного подхода к ведению раннего послеоперационного периода у женщин с бесплодием при I-II степени наружного генитального эндометриоза в зависимости от состояния их иммунной системы (Схема 1). Для прогноза эффективности хирургического лечения бесплодия у этих пациенток рекомендуется до операции определять уровень В-1 лимфоцитов, и при их высоких значениях (2,6% и более)  проводить курс лечения Пентоксифиллином в раннем послеоперационном периоде с целью коррекции иммунологических нарушений и восстановления фертильности. Через 1 месяц после лечения препаратом Пентоксифиллин необходимо проведение повторного иммунологического обследования с оценкой уровня активации реакций гуморального звена иммунитета, для оценки степени нормализации иммунологических параметров и прогнозирования восстановления репродуктивной функции.

Схема 1.
Алгоритм ведения женщин с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза

До проведения хирургического лечения: 
определение относительного содержания
в крови В-1, HLA-DR+, TCRδγ+,IL-4+,CD4+IL-4+, 
IL-5+, CD4+IL-5+,IL-6+, CD4+IL-6+ лимфоцитов 

Уровень В-1 лимфоцитов более 2,6%,
сниженное содержание HLA-DR+ лимфоцитов, повышенный уровень TCRδγ+ и продукции цитокинов 2 типа

Уровень В-1 лимфоцитов
равен или менее 2,6%

Прогнозируется эффективность
хирургического лечения бесплодия у женщин 
с эндометриозом

Включение в комплексное
ведение послеоперационного
периода Пентоксифиллина 

Оценка иммунологических 

Традиционное ведение
послеоперационного периода

показателей через 1 месяц 
после лечения

Прогнозирование наступления
беременности при условии нормализации
иммунологических показателей 
в течение 1 года наблюдения

ВЫВОДЫ
1.	Для женщин с бесплодием, связанным с «малыми» формами наружного генитального эндометриоза характерно: повышенная частота аллергических реакций, самопроизвольные выкидыши на ранних сроках беременности по данным анамнеза, железисто-кистозная гиперплазия эндометрия при обследовании. 
2.	Для женщин с бесплодием, связанным с «малыми» формами наружного генитального эндометриоза, характерно сниженное содержание HLA-DR+ периферических лимфоцитов, увеличенный уровень В-1 клеток, TCRγδ+ лимфоцитов, усиленная экспрессия мРНК и внутриклеточная продукция IL-4, IL-5 и IL-6 лимфоцитами, увеличение содержания Th2 лимфоцитов с фенотипом CD4+IL-4+ и CD4+IL-6+ клеток и повышение сывороточного уровня IL-4 и IL-6 по сравнению с аналогичными показателями у здоровых фертильных женщин.
3.	При воздействии in vitro препарат Аколат приводит к снижению продукции IL-5 периферическими лимфоцитами у здоровых фертильных женщин и к угнетению продукцию цитокинов Th2 типа IL-4, IL-5 и IL-6 у бесплодных женщин с наружным генитальным эндометриозом. При воздействии in vitro препарата Пентоксифиллин на лимфоциты здоровых женщин происходит уменьшение внутриклеточной продукции IL-6 в общей популяции лимфоцитов и продукции IL-4 в популяции Т-хелперов, тогда как при инкубации периферических лимфоцитов женщин с наружным генитальным эндометриозом с препаратом Пентоксифиллин снижается внутриклеточная продукция  IL-4, IL-5 и IL-6 в общей популяции лимфоцитов, а также продукция IL-4 и IL-6 периферическими CD4+ клетками.
4.	Вне зависимости от вида получаемой терапии в раннем послеоперационном периоде у всех женщин с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза после хирургического лечения нормализуется содержание периферических В-1 клеток, HLA-DR+, IL-5+, CD4+IL-6+ лимфоцитов и снижается экспрессия лимфоцитами крови мРНК IL-5 и IL-6. При включении в терапию препарата Пентоксифиллин дополнительно отмечается уменьшение количества TCR+ периферических лимфоцитов и снижение синтеза, внутриклеточной продукции и сывороточного содержания IL-4. При традиционном ведении послеоперационного периода у женщин увеличивается содержание активированных CD20+HLA-DR+ лимфоцитов и усиливается экспрессия мРНК IL-4 периферическими лимфоцитами. 
5.	При традиционном ведении послеоперационного периода наступление беременности у женщин с «малыми» формами наружного генитального эндометриоза отмечено в 20,0% случаев в течение года после операции. Включение Пентоксифиллина в схему ведения раннего послеоперационного периода бесплодных женщин с наружным генитальным эндометриозом приводит к наступлению беременности у 36,7% пациенток, при этом восстановление репродуктивной функции женщин ассоциировано с увеличением HLA-DR+ лимфоцитов, снижением уровня IL-5+, CD4+IL-5+ периферических лимфоцитов после лечения Пентоксифиллином по сравнению с исходным уровнем.
Практические рекомендации
1.	Для определения тактики ведения раннего послеоперационного периода у женщин с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза рекомендуется проводить оценку степени выраженности аутоиммунных нарушений до проведения хирургического лечения на основании определения в периферической крови пациенток относительного содержания CD20+CD5+, HLA-DR+, TCRγδ+ лимфоцитов, продукции лимфоцитами IL-4, IL-5, IL-6.
2.	При значениях относительного содержания CD20+CD5+ лимфоцитов 2,6% и менее прогнозируется наступление беременности после проведения хирургического лечения бесплодия у женщин с «малыми» формами наружного генитального эндометриоза с точностью 77,0%. 
3.	При обнаружении у женщин нарушений активности гуморального звена иммунитета рекомендуется применение препарата Пентоксифиллин в раннем послеоперационном периоде, внутривенно капельно в течение 5 дней по 100 мг в сутки, затем per os по 800 мг в сутки  в течение 5 дней, с целью коррекции системной продукции цитокинов 2 типа и улучшения восстановления фертильности у женщин с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза.
4.	Рекомендуется проведение повторного иммунологического обследования с оценкой уровня активации реакций гуморального звена иммунитета, через 1 месяц после лечения препаратом Пентоксифиллин для оценки степени нормализации иммунологических параметров и прогнозирования восстановления репродуктивной функции
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1.	Шаалали Ю.С., Малышкина А.И., Анциферова Ю.С.  Активация реакций гуморального звена иммунитета и возможность их медикаментозной коррекции у женщин с бесплодием при малых формах наружного генитального эндометриоза // Материалы IV съезда акушеров-гинекологов России. - Москва, 2008.- С.519-520.
2.	Шаалали Ю.С. Экспериментальное обоснование возможности коррекции иммунных нарушений у женщин с бесплодием, обусловленным малыми формами наружного генитального эндометриоза // Материалы научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя Науки – 2008», Иваново. – 2008. С. – 24.
3.	Шаалали Ю.С., Малышкина А.И., Анциферова Ю.С., Шишков Д.Н.   Взаимосвязь активности реакций гуморального звена иммунитета с эффективностью восстановления репродуктивной функции после лапароскопической операции у женщин с эндометриозом и бесплодием  // Проблемы репродукции – 2008. Спец. выпуск. – С. 101 - 102.
4.	Шаалали Ю.С., Малышкина А.И., Анциферова Ю.С. Возможность медикаментозной коррекции иммунных нарушений у женщин с бесплодием при малых формах наружного генитального эндометриоза // Российский иммунологический журнал. – 2008. – Том 2(11). №2-3. С. 301.
5.	Шаалали Ю.С. Влияние in vitro препарата Пентоксифиллин на внутриклеточную продукцию цитокинов периферическими лимфоцитами женщин с бесплодием, ассоциированным с малыми формами наружного генитального эндометриоза. // Материалы научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя Науки – 2009», Иваново. – 2009. С. – 37.
6.	Шаалали Ю.С., Малышкина А.И. Особенности продукции цитокинов Th2 типа периферическими лимфоцитами у женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием // Материалы III международного конгресса по репродуктивной медицине. Москва. – 2009. С. 300-301.
7.	Шаалали Ю.С., Малышкина А.И., Анциферова Ю.С., Шишков Д.Н. Особенности иммунного статуса женщин с наружным генитальным эндометриозом и ассоциированным с ним бесплодием при различных вариантах эффективности хирургического бесплодия // Вестник российской военно-медицинской академии. - 2009. - Прил. 1. - С. 696.
8.	Шаалали Ю.С., Малышкина А.И., Анциферова Ю.С. Обоснование возможности использования Пентоксифиллина для коррекции иммунологических нарушений у женщин с бесплодием, ассоциированным с малыми формами наружного генитального эндометриоза // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, № 4 - 5. -  С. 424 - 425.
9.	Шаалали Ю.С., Анциферова Ю.С., Малышкина А.И. Влияние препарата Пентоксифиллин на продукцию цитокинов Th2 типа у женщин с бесплодием, обусловленным малыми формами наружного генитального эндометриоза // Цитокины и воспаление. Том 8, №3. – 2009. С54-58.
10.	Шаалали Ю.С., Анциферова Ю.С., Малышкина А.И. Влияние Пентоксифиллина на синтез и продукцию цитокинов Th2 типа у женщин с бесплодием, ассоциированным с малыми формами наружного генитального эндометриоза // Материалы Х юбилейного Всероссийского научного форума «Мать и дитя». Москва 2009. - С. 441-442.
11.	Шаалали Ю.С., Малышкина А.И., Анциферова Ю.С. Влияние Пентоксифиллина на иммунологические показатели у женщин с бесплодием, ассоциированным с наружным генитальным эндометриозом // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т.10, №2. - С. - 249.
12.	Малышкина А.И., Шаалали Ю.С., Анциферова Ю.С. Обоснование использования Пентоксифиллина в комплексной терапии наружного генитального эндометриоза и связанного с ним бесплодия // Материалы IV международного конгресса по репродуктивной медицине. Москва. – 2010. С. 197-198.
13.	Шаалали Ю.С. Динамика иммунологических показателей у женщин с бесплодием при малых формах наружного генитального эндометриоза до и после лечения препаратом Пентоксифиллин  // Материалы 90-й юбилейной ежегодной научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя Науки – 2010», Иваново. – 2010. С. – 44.
14.	Шаалали Ю.С., Малышкина А.И., Анциферова Ю.С. Обоснование применения препарата Пентоксифиллин в лечении женщин с бесплодием, обусловленным малыми формами наружного генитального эндометриоза // Актуальные вопросы педиатрии, акушерства и гинекологии. - 2010. - № 2. – С. 90-94.
Список сокращений 
 CD – кластер дифференцировки
 IL - интерлейкин
Th – Т-  
мАТ – моноклональные антитела 
мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота
ПЦР (PCR) – полимеразная цепная реакция